ישיבתו הראשונה של בית המשפט המחוזי בתיק פלילי 40/61 התקיימה ב-11 באפריל 1961, בבית העם בירושלים. ב-15 בדצמבר 1961 הסתיים המשפט בהקראת גזר הדין, שעל-פיו נמצא אייכמן אשם ברוב סעיפי האישום, ודינו נגזר למוות. לתחילתו של המשפט קדמו חודשים ארוכים של הכנה מדוקדקת. במשטרת ישראל הוקמה מחלקה מיוחדת: "לשכה 06", לצורך איסוף המסמכים הרלוונטיים, בחירת העדים והכנתם למתן עדותם, גיבוש קו התביעה ודיון בסוגיות המשפטיות למיניהן. נבחרו כ-1,600 מסמכים, שרובם נשאו את חתימתו של אייכמן, נקבעה רשימה של 108 עדים-ניצולים, וכן רשימת העדים המומחים – היסטוריונים ומלומדים בתחומיהם.
העדים נקראו לפרושׂ את סיפורה המלא והמורכב של השואה, לאו דווקא מן הזווית הקשורה ישירות בנאשם; ואולם כצפוי, פשעיו של אייכמן נשזרו בסיפוריהם במגוון תפקידיו בס"ס, כמתאם, כמארגן וכמנווט שילוחי היהודים לגטאות ולמחנות ההשמדה.
בכתב התביעה הואשם אייכמן בחמישה-עשר סעיפי אישום, ובכללם פשעים נגד העם היהודי ופשעים נגד האנושות. בצוות התביעה נכללו גדעון האוזנר, ששימש בתפקיד היועץ המשפטי לממשלה, ועוזריו גבריאל בך ויעקב בר-אור. בצוות ההגנה שימשו ד"ר רוברט סֶרוַוציוּס ועוזרו דיטר וכטנברוך. הסנגוריה לא התכחשה לעצם העובדות שבכתב האישום, ובחרה בקו של מִזעור אחריותו של הנאשם לפשעי המשטר הגרמני הנאצי כלפי היהודים. ההגנה תיארה את הנאשם כ"בורג קטן במערכת השלטון" וכאיש חסר השפעה בתכנון מכונת הרצח ובהפעלתה. קו ההגנה הטעים את חוסר יכולתו ההיררכית של אייכמן להפר את הוראות הממונים עליו, ואת העובדה שראשי המשטר הגרמני הנאצי, ולא הוא, הם שהחליטו את ההחלטות הפליליות המכריעות. ברם, בעזרת מסמכים ועדויות הצליחה התביעה להוכיח כי הנאשם, חרף דרגתו הנמוכה יחסית, היה דמות בעלת השפעה, יוזמה ומוטיבציה נמרצת והחלטית לגרש את היהודים משטח הרייך הישן לגטאות שבמזרח, שם מצאו רובם את מותם. יתרה מכך, הוכחה אחריותו האישית לשילוח מאות אלפי יהודים למחנות ההשמדה, בייחוד לאושוויץ. השופטים ציינו את נחישותו של הנאשם להמשיך בכל מחיר בגירושם של יהודי הונגריה לאושוויץ, בשלהי 1944, על סף קריסת הרייך השלישי, אף בניגוד לעמדת הממונים עליו ומאחורי גבם.
בהרכב השופטים שדנו בתיקו של אייכמן בערכאה הראשונה בבית המשפט המחוזי כיהנו: משה לנדוי (יו"ר), ד"ר בנימין הלוי ויצחק רווה. ב-13 בדצמבר 1961 קבע בית המשפט שאייכמן אשם ברוב סעיפי האישום, וב-15 באותו חודש גזר את דינו למוות. הסנגוריה ערערה לפני בית המשפט העליון, וזה אִשרר את פסק הדין של בית- המשפט המחוזי, ב-29 במאי 1962. בניסיון אחרון פנה אייכמן בבקשת חנינה אל נשיא המדינה דאז, יצחק בן-צבי, אך הנשיא דחה את בקשתו.
בלילה שבין 31 במאי ל-1 ביוני 1962 הוצא אייכמן להורג בתלייה, בכלא רמלה. בשניות האחרונות טרם מותו ביטא אייכמן את אהבתו ואת נאמנותו ללא סייג לגרמניה ולארגנטינה. לאחר שנשרפה גופתו אפרו פוזר בלב ים, מחוץ למים הטריטוריאליים של מדינת ישראל. משפטנים בעולם כולו, ובכללם אף מי שכפרו תחילה בזכותה של מדינת ישראל לשפוט את אייכמן, ציינו את ההגינות שאִפיינה את השופטים, וכן את השמירה הקפדנית על עקרון משפט הצדק. במהלך המשפט כולו שודרו הדיונים בשידור חי ב"קול ישראל". מאות אלפים מתושבי ישראל האזינו לשידורים בדריכות – בעיקר לעדויות הניצולים – בכל מקום: בבית וברחוב, במקומות העבודה ובבתי-הספר. לשם סיקור המשפט הגיעו לישראל מאות עיתונאים מכל קצווי תבל, וכך זכה המשפט גם לתשומת לב עולמית.